Identifikasi Mikroba Lengkap

I.          JUDUL PERCOBAAN   :    IDENTIFIKASI MIKROBA

II.     TUJUAN PERCOBAAN      :

1.         Mengamati morfologi dan fisiologi mikroba

2.         Membuat pewarnaan bakteri dan menerangkan reaksi kimia yang terlibat serta perbedaan reaksi yang terjadi

III. TINJAUAN PUSTAKA

3.1   Pewarnaan Gram

Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel.

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu gram negatif dan gram positif.

Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.  Karena bakteri gram positif bakteri yang dapat menahan kompleks pewarnaan primer ungu kristal iodium sampai akhir prosedur dan sel bakteri berwarna biru gelap atau ungu. Sedangkan baktri gram negatif merupakan bakteri yang kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai dengan pewarnaan tandingan, yaitu safranin sehingga sel-sel tampak berwarna merah muda pada akhir pewarnaan dan mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel kegunaannya yaitu, untuk melihat atau mengamati bentuk-bentuk sel bakteri dan memberikan sifat reaksi pewarnaan bakteri yang dapat diketahui dengan melihat apakah termasuk gram negatif (berwarna merah) atau gram positif (berwarna biru).

Dalam melakukan pewarnaan Gram terdapat empat macam tahap yang dilakukan antara lain adalah pemberian warna utama Gram A berupa larutan Kristal violet berwarna ungu. Selanjutnya adalah pengintensifan warna utama gram B berupa larutan kalium iodida kemudian pencucia dekolorisasi Gram C berupa alkohol. Dan yang terakhir adalah pemberian warna penutup/pewarna tandingan/counterstain Gram D larutan safranin berwarna merah muda.

Ada dua teknik untuk membekukan prosedur warna Gram yang hasilnya setara ialah teknik Hucker dan teknik Burke. Teknik Burke dalam prosedur ini dikenakan pada sel bakteri yang telah difiksasi, hasil pewarnaan pada bakteri Gram positif berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif berwarna merah muda (Ulfah, 2011).

3.2  Zat Warna

Pewarnaan gram dapat membedakan bakteri dalam dua kelompok yaitu bakteri gram positif dan gram negatif. Teknik pewarnaan ini menggunakan empat macam reagen yang berbeda yaitu :

a.          Kristal violet (pewarna primer) yang digunakan pertama kali dan sel yang terwarnai akan berwarna biru keunguan (violet).

b.         Gram’s Iodine (mordant), yaitu substansi yang dibuat dari campuran larutan yang kompleks, untuk memperkuat ikatan pewarna primer. Hasil dari ikatan antara kompleks kristal violet dan iodine akan mewarnai sel secara intensif.

c.          Ethyl Alkohol 95 % (agen pendekolorisasi), yaitu merupakan reagen yang mempunyai dua fungsi yaitu sebagai agen pendehidrasi protein. Aksi ini dapat dideterminasi melalui jumlah asam lemak yang ada pada dinding sel bakteri.

d.         Safranin (warna penutup), yaitu warna terakhir yang menyebabkan warna merah pada sel, terutama sel yang menyebabkan warna merah pada sel yang telah mengalami dekolorisasi. Pada gram negatif, setelah dekolorisasi, pewarna terkhir ini akan diserap. Pada sel gram positif, akan berwarna biru keunguan yaitu warna primer.

(Mukarromah, 2009).

3.3  Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan

       Hasil pewarnaan tergantung beberapa faktor antara lain:

1.     Fiksasi

Sebelum mikroorganisme, khususnya bakteri di warnai harus dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik dengan pemanasan atau dengan freeze drying atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan menggunakan agensia kimia.

Agen kimia yang dapat dipakai antara lain sabun, fenol , dan formalin.

Fiksasi perlu dilakukan sebelum perwarnaan mikroba berfungsi untuk :

a.          Merekatkan sel mikroba pada gelas objek.

b.         Membunuh mikroorganisme secara cepat dan tidak menyebabkan perubahan – perubahan bentuk dan strukturnya.

c.          Mengubah afinitas (daya ikat ) zat warna.

d.         Membuat sel- sel mikroba lebih kuat.

e.          Mencegah otolisi sel.

f.          Mempertinggi sifat reaktif gugus – gugus tertentu.

2.     Peluntur Zat Warna

Peluntur zat warna adalah suatu senyawa yang menghilangkan warna dari sel yang telah diwarnai. Peluntur zat warna (decolorizer)  berfungsi untuk menghasilakn kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Ditinjau dari kekuatan ikatan antara sel dengan zat warna maka dikenal beberapa istilah, misalnya tahan asam, tahan alkohol dan tahan air. Istilah tahan asam digunakan bila zat warna telah diikat kuat oleh sel sehingga tidak dapat dilunturkan warnanya oleh asam, demikian pula tahan alkohol dan tahan air masing- masing tidak dapat dilunturkan oleh alkohol dan air.

3.     Intensifikasi Pewarnaan

Zat warna dapat diintensfikasi dengan beberapa cara misalnya dengan mempertinggi kadar zat warna, mempertinggi temperatur pewarnaan (60-90 ^oC) dan memambah suatu mordan. Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan sel - sel mikroba dapat diwarnai lebih intensif atau menyebabkan zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel bila dibandingkan dengan cara pewarnaan tanpa di beri mordan.

4.     Substrat

Setiap zat warna apakah zat warna asam atau zat warna basa dapat bereaksi dengan konstituen sel tertentu. Oleh karena itu, substrat organik seperti lipida, protein, asam-asam, nukleat dan karbohidrat juga mempengaruhi pewarnaan. Atas dasar macam zat warna yang diserap oleh sel, dapat dibedakan :

a.          Sel - sel yang basofil.

b.         Sel - sel asidofil atau oksifil.

c.          Sel - sel yang sundafonil.

5.     Zat Warna Penutup atau Zat Warna Lawan

Zat Warna Penutup atau Zat Warna Lawan adalah suatu zat warna basa yang berbeda warnanya dengan zat warna mula- mula digunakan. Fungsi dari Zat Warna Penutup adalah memberikan warna pada sel yang berbeda warnanya dengan zat warna mula-mula (Waluyo, 2010).

3.4  Aplikasi Pewarnaan Gram

“Identifikasi Mikroba Anaerob Dominan Pada Pengolahan Limbah Cair  

Pabrik Karet Dengan Sistem Multi Soil Layering (Msl)”

1.         Pengolahan limbah cair karet dengan menggunakan reaktor MSL

Reaktor MSL yang digunakan dalam kondisi reaktor sudah steady state yaitu kondisi dimana efluen dari reaktor MSL memiliki nilai yang sudah stabil dilihat berdasarkan enam parameter yaitu BOD, COD, TSS, total amoniak, total nitrogen dan pH dengan laju aliran saat pengolahan optimum.

2.         Pengambilan sampel tanah pada tiga lapisan paling atas dengan jarak 5 cm,

10 cm, 25 cm dari permukaan MSL.

3.         Identifikasi Bakteri

a.          Sterilisasi alat dan bahan menggunakan inkubator autoklaf.

b.         Isolasi bakteri dengan menggunakan medium nutrient agar (NA) yang

       berbentuk padat, sehingga terbentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya.

c.          Penghitungan total bakteri dengan alat penghitung koloni (colony counter).

d.         Pemurnian bakteri dengan menggunakan medium NA modifikasi. Teknik isolasi yang digunakan adalah metode preparat spread plate atau streak plate.

e.          Pengamatan secara makroskopis terhadap perbedaan warna, bentuk permukaan dan pinggiran koloni yang dilakukan setiap tahapan isolasi bakteri.

f.          Pewarnaan gram menggunakan teknik pewarnaan bertingkat.

g.         Pengamatan secara mikroskopis.

h.         Uji reaksi biokimia.

4.         Mikroorganisme Dominan

Untuk mendapatkan jenis bakteri dominan yang berperan dalam pengolahan

biologis limbah cair karet dilakukan pencocokan karakteristik fisik dan biokimia (Helard, 2005).

IV.    METODOLOGI PERCOBAAN

4.1        Bahan dan Fungsi

Adapun bahan yang digunakan dalam percobaan adalah :

1.      Air rendaman pir

      Fungsi : sebagai sampel yang akan diamati mikroba akuatiknya.

2.      Air parit Suka Ramai

      Fungsi : sebagai sampel yang akan diamati mikroba akuatiknya.

3.      Kristal violet

Fungsi : sebagai bahan pewarna primer.

4.      Larutan iodin

Fungsi : untuk memperkuat ikatan pewarna primer.

5.      Aseton Alkohol

Fungsi : sebagai zat pencuci larutan kristal violet.

6.      Safranin

Fungsi : sebagai larutan pewarna yang tetap/zat pewarna.

4.2           Alat dan Fungsi

Adapun peralatan yang digunakan dalam percobaan adalah :

1.      Mikroskop

      Fungsi : untuk melihat mikroba yang diletakkan di bawah lensa objektif dengan mengatur perbesaran yang tepat agar objek terlihat dengan jelas.

2.      Kawat inokulasi

      Fungsi : untuk menggoreskan sampel bakteri dan jamur pada kaca benda

3.      Kaca benda

      Fungsi : untuk meletakkan objek yang akan diamati.

4.      Lilin

      Fungsi : sebagai sumber api untuk proses fiksasi dan mensterilkan kawat inokulasi.

5.      Pipet tetes

      Fungsi : untuk mengambil bahan pewarna pada saat proses pewarnaan.

6.      Penjepit Tabung

      Fungsi : alat untuk menjepit kaca objek pada proses fiksasi dan pencucian.

7.      Tisu

      Fungsi : untuk mengeringkan kaca benda dari cairan yang tersisa.

4.3        Prosedur Percobaan

4.3.1     Prosedur Pengamatan Mikroba Lingkungan

1.      Mikroskop diatur sedimikian rupa sehingga dapat digunakan dengan jelas dan baik, antara lain dengan membersihkan kaca dan cermin dengan tisu, serta mengatur penyinaran yang baik.

2.      Kaca objek dibasahi dengan aquadest dan dilap dengan tisu hingga bersih.

3.      Dengan memakai pipet tetes atau kawat inokulasi, sampel air parit Suka Ramai ditetes atau digoreskan pada kaca objek.

4.      Preparat diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran yang sesuai dan diatur sejelas mungkin.

5.      Digambarkan hasilnya. Hasil yang terlihat dibandingkan dengan referensi agar mikroba tersebut dapat diidentifikasi.

4.3.2     Prosedur Pewarnaan Gram

1.      Mikroba dibiakkan selama 20-24 jam dalam rendaman air pir.

2.  Preparat diambil dengan menggunakan kawat inokulasi yang telah di serilkan terlebih dahulu dengan lilin.

3.      Bakteri digoeskan ke atas kaca objek lalu dibiarkan kering  diudara terbuka kemudian kaja objek di fiksasi diatas api lilin.

4.      Diamati di bawah mikroskop.

5.      Digambar hasil yang didapat.

6.  Preparat dibasahi dengan kristal violet dibiarkan  selama 30-60 detik lalu preparat dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih kemudian dicuci lagi dengan air.

7.   Kemudian preparat dibasahi dengan iodin dibiarkan selama 30-60 detik lalu preparat dimiringkan untuk membuang cairan yang berlebih kemudian dicuci lagi dengan air.

8.   Dilanjutkan dengan menggunakan alkohol – aseton dibiarkan selama 30-60 detik. Kemudian dicuci lagi dengan air.

9.    Kemudian  preparat dicuci  dengan pewarna lengkap safranin dibiarkan  selama 30-60 detik. Kemudian dicuci lagi dengan air.

10.  Preparat dikeringkan dengan tisu lalu diamati dengan mikroskop dan hasilnya digambar.

V.       HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1           Pembahasan

5.1.1  Pengamatan Mikroba Lingkungan

Pengamatan mikroba lingkungan adalah suatu kegiatan yang merujuk pada indentifikasi suatu mikroorganisme yang terdapat pada suatu lingkungan yaitu pada air. Pengamatan ini dapat memberi gambaran mikroba yang terdapat pada lingkungan yang diamati, baik morfologi maupun fisiologi dari bakteri tersebut. Dari pengamatan yang telah dilakukan pada air parit pasar Suka Ramai diperoleh bakteri yang terkandung adalah Rhodospirillum rubrum.

Rhodospirillum adalah genus bakteri fotosintetik dari Rhodospirillaceae keluarga. sel-sel mereka umumnya berbentuk spiral, polarly flagellated dan mengandung vesikuler, pipih membran fotosintesis ditumpuk (Singleton dan Sainbury). Mereka berkisar dari tiga sampai sepuluh mikrometer panjang dan satu-setengah sampai satu setengah mikrometer satu di lebar. Salah satu jenis spesies dari genus ini adalah Rhodospirillum rubrum adalah bakteri gram negatif yang mengandung asam lemak tak jenuh dan jenuh (Amirien, 2011).

5.1.2  Pewarnaan Gram

Pada percobaan dari tabel pengamatan untuk sampel air rendaman pir 20 jam ditemukan bakteri Rhodospirillum rubrum. Rhodospirillum adalah genus bakteri fotosintetik dari Rhodospirillaceae keluarga. sel-sel mereka umumnya berbentuk spiral, polarly flagellated dan mengandung vesikuler, pipih membran fotosintesis ditumpuk (Singleton dan Sainbury). Mereka berkisar dari tiga sampai sepuluh mikrometer panjang dan satu-setengah sampai satu setengah mikrometer satu di lebar. Salah satu jenis spesies dari genus ini adalah Rhodospirillum rubrum adalah bakteri gram negatif yang mengandung asam lemak tak jenuh dan jenuh (Amirien, 2011).

Oscillatoria adalah genus dari berserabut Cyanobacterium yang adalah nama untuk osilasi dalam gerakannya. Filamen dalam koloni dapat geser bolak-balik terhadap satu sama lain sampai massa seluruh reorientasi ke sumber cahaya. Hal ini umumnya ditemukan di air-air palung, dan terutama biru-hijau atau coklat-hijau. Oscillatoria adalah organisme yang mereproduksi oleh fragmentasi. Oscillatoria bentuk filamen panjang sel yang dapat masuk ke fragmen disebut hormogonia.

Hormogonia dapat tumbuh menjadi filamen baru yang lebih panjang. Istirahat dalam filamen biasanya terjadi di mana sel-sel mati (necridia) yang hadir Oscillatoria menggunakan fotosintesis untuk bertahan hidup dan bereproduksi.. Setiap filamen Oscillatoria terdiri dari trikoma yang terdiri dari baris sel. Ujung trikoma berosilasi seperti pendulum (Wikipedia, 2012).

Mekanisme pewarnaan gram yaitu kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam, dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (Ungu). Iodium yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Alkohol-aseton merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan :

1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu.

2. Bakteri menjadi tidak berwarna.

Safranin berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol.

Dari percobaan yang telah dilakukan pada air rendaman pir 20 jam diperoleh bakteri Rhodospirillum rubrum dan pada air rendaman pir 24 jam diperoleh bakteri Oscillatoria. Identifikasi mikroba yang didapat tidak sesuai dengan sumber yang ada disebabkan waktu dekolorisasi terlalu pendek maka sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek. Dimana bakteri Rhodospirillum rubrum dan Oscillatoria merupakan bakteri jenis gram negatif yang ditandai dengan warna merah (Tarigan, 2011).

Secara teori salah satu bakteri yang menyerang buah pear adalah Erwinia amylovora. Erwinia adalah sebuah genus bakteri gram negatif dari famili Enterobacteriaceae (Dwi, 2011).

Sedangkan hasil yang didapat adalah bakteri Rhodospirillum rubrum dan Oscillatoria sehingga hasil yang didapat tidak sesuai dengan teori. Hal ini disebabkan oleh tercemarnya biakan (Kurniawan, 2012).

Jadi dapat disimpulkan percobaan untuk pewarnaan gram tidak sesuai dengan teori dan bakteri yang terdapat pada pengamatan buah pir juga tidak sesuai dengan teori. 

Referensi :

Amiren, Ronye. 2011. Rhodospirillum Rubrum. roniamirin.blogspot.com/2011/04/ rhodospirillum-rubrum.html. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Dhyfa, Faiz. 2010. Rhodospirillum Rubrum. http://www.scribd.com/doc/41981934/ Macam-macam-Bakteri. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Dwi, Apriyanto. 2011. Erwinia Amylovora. http://ulerkepompongkupu.blogspot. com/2011/12/erwinia-amylovora_08.html. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Helard, Denny dan Putri Sri Komala. 2005. Identifikasi Mikroba Anaerob Dominan Pada Pengolahan Limbah Cair Pabrik Karet Dengan Sistem Multi Soil Layering (Msl).                           repository.unand.ac.id/4048/1/Deny_Helart_Artikel.pdf. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Kurniawan, Prasetyo Hendy. 2012. Identifikasi Bakteri – Morfologi Koloni Dan Morfologi Sel. http://www.scribd.com/doc/89466956/P-Mikrobiologi-Acara-4-Identifikasi-Bakteri-Morfologi-Koloni-Dan-Morfologi-Sel. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Mukarromah, Shofiyani. 2009. Laporan Praktikum Mikrobiologi Dasar. http://www .scribd.com/doc/74672990/11/Pewarnaan-Gram. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Tarigan, Era. 2011. Tujuan Membedakan Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. http://www.scribd.com/doc/53611697/25146430-Tujuan-Membedakan-Bak teri-Gram-Positif-Dan. Diakses pada : 7 Oktober 2012.

Ulfah, Adelaide Maria. 2011. Pewarnaan Gram. http://adelaidearsenal.blogspot .com/2011/10/ jurnal-pewarnaan-gram.html. Diakses pada : 7 Oktober 2012

Waluyo, Lud. 2010. Teknik dan Metode Dasar Mikrobiologi. Universitas Muhammadiyah Malang : Malang.

Wikipedia. 2012. Oscilatoria. http://en.wikipedia.org/wiki/Oscillatoria. Diakses pada : 7 Okrober 2012.